Agarosa en polvo D1 Low EEO

1. Preparación del gel

1. Pesar la masa apropiada de agarosa en un matraz Erlenmeyer. Los geles de agarosa se preparan usando p / v solución porcentaje. La concentración de agarosa en un gel dependerá de los tamaños de los fragmentos de ADN que se separaron, con la mayoría de los geles que oscilan entre 0,5% -2%. El volumen del tampón no debe ser mayor que 1/3 de la capacidad del matraz.
2. Añadir tampón de agarosa al matraz que contiene. Agite para mezclar. El gel más común que los amortiguadores son TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) y de TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).
3. Fundir la mezcla de agarosa / tampón. Esto se realiza comúnmente mediante el calentamiento en un horno de microondas, pero también se puede hacer sobre una llama de Bunsen. En intervalos de 30 s, retirar el matraz y agitar el contenido para mezclar bien. Repita hasta que la agarosa se haya disuelto completamente.
4. Añadir bromuro de etidio (EtBr) a una concentración de 0,5 g / ml. Alternativamente, el gel puede también ser teñidas después de electroforesis en el funcionamiento de un tampón que contiene 0,5 mg / ml de bromuro de etidio durante 15-30 minutos, seguido de decoloración en la gestión de búfer por un período igual de tiempo.

Nota: EtBr es un carcinógeno y debe desecharse de forma adecuada según las regulaciones de la institución. Los guantes deben ser usados ​​siempre al manipular geles que contienen bromuro de etidio. Tintes alternativos para la tinción de ADN se encuentran disponibles, sin embargo EtBr sigue siendo el más popular debido a su sensibilidad y costo.

5. Dejar que la agarosa se enfríe bien en la mesa de trabajo o por incubación en un baño de 65 ° C el agua. De no hacerlo, se tuerza la cubeta.
6. Coloque la bandeja de gel en el aparato de fundición. Alternativamente, también se puede pegar los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde. Colocar un peine adecuado en el molde de gel para crear los pocillos.
7. Verter la agarosa fundida en el molde de gel. Permitir la agarosa para establecer a temperatura ambiente. Retirar el peine y colocar el gel en el cuadro de gel. Alternativamente, la gEl también puede ser envuelto en una envoltura de plástico y se almacenó a 4 ° C hasta su uso (fig. 1).

2. Puesta en marcha de aparato de gel y la separación de fragmentos de ADN

1. Añadir colorante de carga para las muestras de ADN para ser separados (fig. 2). Gel de carga de colorante se hace típicamente en una concentración 6X (0,25% azul de bromofenol, 0,25% cianol xileno, 30% de glicerol). Cargando medio de contraste ayuda a realizar un seguimiento de hasta qué punto su muestra de ADN ha viajado, y también permite que la muestra se hunden en el gel.
2. Programa de la fuente de alimentación a la tensión deseada (1-5V/cm entre los electrodos).
3. Añadir tampón suficiente corriente para cubrir la superficie del gel. Es importante utilizar el mismo tampón se ejecuta como el utilizado para preparar el gel.
4. Coloque los cables de la caja de gel a la fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación y verificar que tanto la caja de gel y la fuente de alimentación están trabajando.
5. Retire la tapa. Despacioy cuidadosamente cargar la muestra de ADN (s) en el gel (fig. 3). Un marcador de ADN de tamaño apropiado se deberán colocar siempre junto con las muestras experimentales.
6. Sustituir la tapa para la caja de gel. El cátodo (cables de color negro) debe estar más cerca de los pozos que el ánodo (cables rojos). Compruebe que los electrodos se conectan en las ranuras correctas en la fuente de alimentación.
7. Encienda la alimentación. Ejecutar el gel hasta que el colorante ha migrado a una distancia apropiada.

3. Observando separados por fragmentos de ADN

1. Cuando se ha completado la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire la tapa de la caja de gel.
2. Quitar el gel de la cubeta. Escurrir el exceso de tampón de la superficie del gel. Coloque la bandeja de gel en las toallas de papel para absorber el búfer adicional en ejecución.
3. Quitar el gel de la bandeja de gel y exponer el gel a la luz UV. Esto se realiza comúnmente mediante un sistema de documentación de gel (fig. 4). Las bandas de ADN debe mostrararriba como bandas fluorescentes de color naranja. Toma una fotografía del gel (fig. 5).
4. Deseche el gel y el tampón de acuerdo a las normas de la institución.

4. Los resultados representativos

La figura 5 representa un resultado típico después de electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. Después de la separación, los fragmentos de ADN resultantes son visibles como bandas claramente definidas. El estándar de ADN o escalera debe ser separado a un grado que permita la determinación útil de los tamaños de las bandas de la muestra. En el ejemplo mostrado, fragmentos de ADN de 765 pb, 880 pb y 1022 pb se separó en un gel de agarosa al 1,5% junto con una escalera de ADN de 2-log.

Figura 1. Un solidificado en gel de agarosa después de la eliminación del peine.

Figura 2. Un estudiante de la adición de colorante de carga a las muestras de su ADN.

Figura 3. Un estudiante cargar la muestra de ADN en un pozo en el gel.

Figura 4. Un ejemplo de un sistema de documentación en gel.

Figura 5. Una imagen de una electroforesis en gel de mensaje. EtBr se añadió a la electroforesis en gel antes a una concentración final de 0,5 g / ml, seguido de la separación a 100 V durante 1 hora. El gel se expone a la luz UV y la imagen tomada con un sistema de documentación de geles.

Conclusión

Electroforesis en gel de agarosa ha demostrado ser una manera eficiente y eficaz de separar los ácidos nucleicos. Alta resistencia del gel de agarosa, permite la manipulación de los geles porcentuales bajos para la separación de grandes fragmentos de ADN. Tamizado molecular se determina por el tamaño de poros generados por los haces de agarosa ⁷ en la matriz de gel. En general, cuanto mayor sea la concentración de agarosa, menor es el tamaño de los poros. Tradicionales geles de agarosa son más eficaces en la separación de los fragmentos de ADN entre 100 pb y 25 kb. Para separar fragmentos de ADN de más de 25 kb, uno tendrá que utilizar campo pulso electroforesis en gel de ^6, que implica la aplicación de corriente alterna a partir de dos direcciones diferentes. De este modo grandes fragmentos de ADN de tamaño están separados por la velocidad a la que ellos mismos reorientar con los cambios en la dirección de la corriente. Los fragmentos de ADN más pequeñas que 100 pb se separó más eficazmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. A diferencia degeles de agarosa, la matriz de gel de poliacrilamida se forma a través de una reacción de radicales libres químico accionado. Estos geles son más delgados de mayor concentración, se corren en forma vertical y tienen una mejor resolución. En el ADN moderno secuenciación electroforesis capilar se utiliza, por lo que los tubos capilares se llenan con una matriz de gel. El uso de tubos capilares permite la aplicación de altas tensiones, lo que permite la separación de fragmentos de ADN (y la determinación de la secuencia de ADN) de forma rápida.

La agarosa se puede modificar para crear bajo punto de fusión a través de agarosa hidroxietilación. Agarosa de bajo punto de fusión se utiliza generalmente cuando el aislamiento de fragmentos de ADN separados se desea. Hidroxietilación reduce la densidad de empaquetamiento de los haces de agarosa, la reducción efectiva de su tamaño de poro ^8. Esto significa que un fragmento de ADN del mismo tamaño se necesitará más tiempo para mover a través de un bajo punto de fusión en gel de agarosa en oposición a un estándar de gel de agarosa. Debido a que los haces de asociarse con un otroa través de interacciones no covalentes ^9, es posible volver a fundir un gel de agarosa después de que se ha fijado.

Bromuro

EtBr es el reactivo más común usado para teñir ADN en geles de agarosa ^10. Cuando se expone a la luz UV, los electrones en el anillo aromático de la molécula de etidio se activan, lo que conduce a la liberación de energía (luz) como el retorno electrones a estado fundamental. EtBr funciona por sí mismo intercalando en la molécula de ADN de una manera dependiente de la concentración. Esto permite una estimación de la cantidad de ADN en cualquier banda de ADN particular, sobre la base de su intensidad. Debido a su carga positiva, el uso de EtBr reduce la tasa de migración del ADN en un 15%. EtBr es un mutágeno y carcinógeno sospechoso, por lo tanto se debe proceder con cuidado al manipular geles de agarosa que lo contienen. Además, EtBr se considera un residuo peligroso y debe ser desechado de manera adecuada. Manchas alternativos para ADN en geles de agarosa son SYBR Gold, SYBR Green, cristal violeta y azul de metilo. De éstos,El azul de metilo y violeta cristal no requieren la exposición del gel a la luz UV para la visualización de las bandas de ADN, reduciendo así la probabilidad de mutación si la recuperación del fragmento de ADN desde el gel se desea. Sin embargo, sus sensibilidades son menores que el de EtBr. SYBR oro y verde SYBR son altamente sensibles, tintes UV dependientes con menor toxicidad que EtBr, pero son considerablemente más caros. Además, todos los tintes alternativos, o bien no puede ser o no funcionan bien cuando se añade directamente al gel, por lo tanto, el gel tendrá que ser teñido posterior después de la electroforesis. Debido a coste, facilidad de uso, y la sensibilidad, EtBr sigue siendo el tinte de elección para muchos investigadores. Sin embargo, en ciertas situaciones, como cuando la eliminación de residuos peligrosos es difícil o cuando los jóvenes estudiantes están realizando un experimento, un medio de contraste menos tóxicas pueden ser preferibles.

Tintes de carga

Utilizados en electroforesis en gel sirven para tres propósitos principales. Primero se añade a la densidad de la muestra, Permitiendo que se hunda en el gel. En segundo lugar, los tintes proporcionar color y simplificar el proceso de carga. Finalmente, los colorantes se mueven a velocidades estándar a través del gel, lo que permite la estimación de la distancia que los fragmentos de ADN han migrado.

Los tamaños exactos de los fragmentos de ADN separados puede determinarse trazando el registro del peso molecular de las distintas bandas de un estándar de ADN contra la distancia recorrida por cada banda. El estándar de ADN contiene una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños predeterminados que pueden ser comparados contra las muestras de ADN desconocidos. Es importante señalar que las diferentes formas de ADN se mueven a través del gel a diferentes velocidades. ADN plásmido superenrollado, debido a su conformación compacta, se mueve a través de la más rápida en gel, seguido por un fragmento de ADN lineal del mismo tamaño, con la forma circular abierta viajar el más lento.

En conclusión, desde la adopción de geles de agarosa en la década de 1970 para la separación de ADN, que tienedemostrado ser una de las técnicas más útiles y versátiles en la investigación ciencias biológicas.